国外苜蓿生物技术研究进展
龙瑞军　　毕玉芬　　马晕玲　　魏小红　　刘建荣
甘肃农业大学西部苜蓿研究中心　　甘肃农业大学草业学院

     在发达国家，转基因工程技术已被广泛用于苜蓿研究的许多领域，并在苜蓿抗性育种、减少膨胀病危害、提高干物质消化率、生物可降解材料开发、生物土壤改良、生物疫苗及活性制剂等方面取得了进展和突破。相反国内在上述方面的研究未起步或差距较大，为此，我们依据美国1998和2000年苜蓿大会论文集（网络版）和DeborahA.Samac,E.CharlesBrummer等的1998苜蓿生物技术研究报告资料分区介绍如下：
      1加拿大
      在魁北克省农业和农业仪器研究机构的科研人员，采用基因工程技术对抗寒苜蓿中的抗寒基因表达生气勃勃性进行了广泛的研究，主要工作包括：1）对从抗寒苜蓿cDNA库中分离出来的表达序列标记（ESTs）进行高产潜力分析；2）通过DNA分子标记和基因谱分析苜蓿抗寒和抗冻性；3)以具防冻功能糖的积累指标评价苜蓿的适应性和潜在性状的选择；4)建立综合指标评价环境和苜蓿田间管理措施，如土壤湿度、冰冻、秋季刈割等对调控苜蓿抗冻性的分子和基因变异方面的影响；5)极地根瘤菌株协同基因的遗传特性；6)对极地根瘤菌的生瘤基因和诱导基因进行分离和排序。
      McGill大学，的研究者正探索在分子水平上对苜蓿抗寒性进行调控。采取的主要措施有：1)分离和鉴别抗寒基因的特性；2)研究有关基因的调控功能；3)植物体低温信号的传导。
      在Guelph大学，Larry Erickson等人，正在采用免疫定位和反义方法从事花粉特异蛋白功能的研究，其主要目的是建立和应用平台技术以表达苜蓿肽的生物活性，包括控索组织的特异和诱导因子及融合蛋白特征，发现了某些基因的表达与猪口服疫苗的病毒抗原、猪表皮生长因子及防卫机制有关。Steve Bowley和Bryan McKersie采用基因工程技术结合田间育种措施，改总部苜蓿对环境抵御能力、碳水化合物代谢、生长素分泌等，从而改进苜蓿抗寒性、生长和质量性状。主要措施包括：1)抗寒类生长和调控物质的分离；2)转基因苜蓿的试验和田间评价；3)转基因技术在常规育种学中的应用；4)基因知识产权的确认和转让。同时与美国Florida和Purdue大学的合作者一起，对苜蓿热应激反应及机制、抗性进行了研究。
      在Manitoba 大学,Rob Hill 和Christos Doras试图通过Agrobacterium tumefaciens和A.rhizogenesas菌株作为载体，将大麦顺、反血红素基因转到苜蓿体内，以提高苜蓿植株抗水淹能力。
      加拿大农业和食品局的M.Gruber女士，正在努力改变转基因苜蓿中控制第二性代谢物单宁积累的基因表达，以减低瘤胃膨胀发生。
      加拿大维多利亚大学的Santosh Misrat和美国Lidia Watrud一起对人类金属硫因基因对苜蓿铜积累及根际微生物群落的影进行研究，发现转基因植物嫩枝叶(根尖)用CuSO4处理后表现出金属硫因所具有的增加铜积累的特征；同样在转与非转基因的灌木上进行类仿实验没有明显效果。他们还将进一步测定这些植物对土壤污染的生物改良作用。
      2美国
      美国Beltsville农业研究中心的T.A Campbell等人正在利用微卫星技术研究苜蓿的休眠问题；N. O'Neill于具有在探索进化和遗传的关系及苜蓿一些真菌叶状病原体的特性等。G. Bauchan等人采用基因组显带和计算机图象技术对四倍体苜蓿的9个种质资源的非休眠类型进行研究，以览别单个染色体和区分休眠与非休眠苜蓿类型。 在明尼苏达州立大学，D.A.Samac,C.P.Vance和H.Jung,将农业微生物菌株转移到生长苜蓿体内以增强抗病性；其他诸如增加苜蓿对酸性土壤中铝的耐性，通过改变苜蓿茎细胞壁成分产生可降解的塑胶聚合体、多羟基丁酸盐等作为高附加值产品。研究人员也对名尼苏达Phoma medicaginis种妖的基因和病原多样性采用rDNA序列和AFLP方法进行了分析。在苜蓿品种Medicago truncatula上，微生物交互作用和T-DNA插入突变异种基因表达序列标记(ESTs)已弄清楚。
      在爱荷华州立大学，E.C.Brummer等人结合基因图谱、基因组和常规育种技术对苜蓿杂种优势和抗寒性进行了研究；他们采用RFLP和AFLP联合标记技术构建了双倍和四倍体苜蓿的基因图谱。应用定量定性定位分析法(QTL)绘制了调近代苜蓿产量、质量、形态特征、越冬率和秋季生长潜力的基因图谱；结合多基因图谱技术定位并分离出与光周期和温度有关的诱导冬眠的基因。基于上述基础，通过绘制各苜蓿品种根部控制生理和代谢基因图谱，从而构建控制冬眠和抗寒性多基因框架图。
      在堪萨斯州立大学农学系的St.Amand和D.C.Clark正在研究可用于选择同源多倍体苜蓿的基因标记，用以提高抗炭疽病等危害。Nebraska大学的M.B.Dickman已鉴定出一组具有信号传导功能的基因，包括激酶、小球蛋白和钙调控蛋白基因等。
      3墨西哥
      在墨西哥的Cuernavaca固氮研究中心，由G.Hernandez领导的科研组正在试图通过改进苜蓿株体和根瘤菌的互作来增强二 协同能力。在转基因苜蓿上，他们发现了对协同作用具有超常表达或抑制作用的基因，如控制胺生成的基因编码。
      4欧洲
      在保加利亚，Kostinbrod马里亚纳群岛基因工程研究所的Vlahova和同事们正在对直接由苜蓿体细胞形成的胚胎发生过程进行细胞学和分子生物学基础研究。他们在未分离的细胞中已经发现了一个表达水平较低的循环独立蛋白质激酶cdc2,cdc2只能在分离的细胞中起到分裂细胞和循环表达的作用。他们还在进行搞除草剂转基因苜蓿的选育，试图提高苜蓿控制Cuscuta spp.杂草的能力。用于构建Basta抗性和Glean抗性的基因已经被引入到苜蓿中，预期转移效果的描述正在进行之中。一种转基因方法也被用于改良苜蓿的消化率方面。在双倍35S探针的控制下，来自Phenylpropanoid路径的白杨木基因编码caffeoy1 COA 3—0甲基转换酶已经被引入到感知和反感知定位。所有转基因植株都有正常的表现，且能正常授粉。有四个植株木质素含量比对照低20%～22%。木质素成分的分析以及进一步的分子生物学分析正在进行之中。
      法国，Lusignan INRA 研究中心的Bernadette Julier—Koubaiti 和Christian Huyghe 正进行有磁苜蓿基因图谱和基因转移方面的工作。按黄萎病和炭疽病的抗性、倒伏性、秋眠性、消化率等农艺性状的差异，他们选择了二个亲本植株组配成杂交组合，并建立了苜蓿杂种一代(F1)的种群基因图谱，他们还建立了目前用AFLP标记进行鉴定的180个F1植株以及将用微星标记的来源于M.Truncatula 苜蓿的植株的基因图谱。F1植株种于田间，每一个植株周围都种植欧洲品种。F1后代植株于2001年播种，以进寿农艺性状评价和不同特性鉴定 的QTL分析。苜蓿转基因项目目的是调整lsoprenoid途径，包括几种生长素的合成。在烟草中，甲羟戊酸酶在路径开始基因编码的全部表达提高了表现型发育速率和叶大小。这种基因对苜蓿生长和牧草生长和牧草质量的影响将在条播和竞争条件下进行。
      在匈牙利的遗传研究所，Szeged,G.B.Kiss和同事们已构建了一种高度饷伯紫花苜蓿基因连接图谱，用了大约2000个基于RFLP和PCR的基因标记，这些基因标记所用材料为紫花苜蓿变种Medicago sativa ssp.coeruleat和Medicago sativa ssp.quasifalcata。这种基因图谱被用于基于图谱进行克隆的基因隔离。一个BACcontig含有一个具有共生固氮的一个基因，该基因通过调节表现型-瘤的有无来实现固氮，该基因的序列已被分析 ，且发现其含有多侯选基因。在M.Sativa和M.Truncatula苜蓿中已经发现了高度的大量和微量同线性，而Medicago和Arabidopsis之间的同线性许诺还在控究中。
      意大利Perugia大学的F.Veronesi、和D.Rosellini主要在苜蓿育种、遗传和分子生物学标记的利用方面开展式作。他们用分子生物学标记技术对二倍体苜蓿、特性 和陆生种(Landraces)的2n卵细胞和花粉的生产进行了基因图谱分析。一篇关于苜蓿属种间分子生物学标记的固复转转置子(retrotransposon)的发展和应用的论文很快提交。包括研究孢子遗传突变体特征的项目将进行控制二倍体卵细胞和花粉生产，以及雌性不育性的鉴定。在比利时Gent的植物基因系统研究中心已经获得了雄性不育苜蓿植株，该植株是用一个含有杆菌淀粉液化(Bacillus amyloliquefaciens)RNAse(Barnase)基因的探针（construct)在pTA29即一个烟草花粉囊绒毡层的特殊启动区的控制下进行黑心基因而成。F1植株比初始受体表现出较高的不育率，说明通过固交将这种特性转移到不同的遗传受体中是可以获得好的雄性不育植株的。
      意大利牧草饲料基因研究会（CNR）的S.Arcioni及同事们正在将生物技术工具应用在牧草育种的不同方面。F.Damiani和F.Paolocci正在鉴定和分离具小角的基因位点，包括合成缩合单宁以产生无膨胀危害苜蓿植株的长期目标。为了提高苜蓿硫酸氨水平和具小角基因位点，M.Bellucci正将编码为β和γ玉黍醇溶蛋白的玉米基因引入苜蓿。F.Pupilli采用分子标记方法鉴定苜蓿和草坪草种群、生态型和品种；同时结合染色体带谱和其他方法鉴定基因对雀稗属单显性组合的无融合生殖的作用。A.Mariani在与自交有关的时代更替出现的不同水平上，分析了苜蓿的微小和大孢子生殖情况。
      在俄罗斯新西伯利亚细胞和基因学研究所，E.V.Deineko等人正在对转基因苜蓿开展基因表达和调控方面的研究以生产口服疫苗。一种适应当地环境的转基因苜蓿已经育成，他携带的可表达esat6和mpt64的转基因具有防止分枝杆菌和结核菌感染的功能。
      5亚洲和澳洲
      澳洲科工部的有关科技人面Tony Ashton和Paul Chu等试图通过微生物果聚糖转基因表达和森质转基因修饰，改进苜蓿茎秆消化率和营养价值。控制缩合单宁合成的基因正在补试图克隆到苜蓿植株以降低蛋白质在瘤胃内消化速度减少苜蓿鼓胀病的危害。最近在苜蓿花叶病毒免疫研究方面已取得了成果。 昆士兰大学的John Irwin等人，应用分子标记技术，改良苜蓿品种以促进苜蓿产业化发展。利用基因多样性技术鉴定澳洲苜蓿栽培品种变异程度的基础上也正进行中。