苜蓿遗传改良的进展及前景
米福贵　云锦凤--内蒙古农业大学

    ［摘要］遗传改良是植物种质资源利用和新品种培育的基础性工作。作为重要的饲用牧草，苜蓿遗传改良的研究一直受到国内外专家学者的重视。经过数十年不懈的努力，人们在提高苜蓿种子及饲草产量、改善饲草品种、增强品种抗性及适应性等方面已取得了丰硕的成果，有力地推动了草地畜牧业乃至农业生产的发展。
     本文从苜蓿遗传育种改良所用方法及技术路线入手，对不同品种类型的培育利用及在生产中的地位等作了简要的回顾与评价。结果表明，传统的远缘杂种培育、综合品种配制、雄性不育系利用等育种方法在当今的苜蓿遗传改良中仍具有较强的现实意义和实用性。
     随着分子生物技术的不断发展与应用，苜蓿新品种培育及杂种优势的手段和方法也在不断丰富与完善之中。文中提到了苜蓿外植体诱导、体细胞杂交、原生质体融合、基因转导等方面的一些研究成果。这表明苜蓿遗传改良的途径十分广阔，其前景是十分诱人的。
     1引言
     苜蓿属（Medicago)为豆科植物。全属共含56个种（McCoy and Bingham,1988)，依生育期的不同，分为一年生和多年生两大类群。一年生物种以自花授粉为主，多年生物种全部为异花授粉型。苜蓿属的染色体基数通常为X＝8，但也有X＝7的情况。大多数种类为二倍体和四倍体，仅有少数种（M.arborea,M.sexatilis)为六倍体。该属植物起源于土耳其和高加索山地，前一地区形成了亚洲及远东的生态型，后者则是欧洲及北美生态型的发源地（Genier et al.,1993)。至于苜蓿属的核型，根据现有研究资料来看，无论是二倍体还是四倍体，均为“1A型”，染色体组型公式，四倍体为2n=4x=32m，二倍体为2n=2x=16m，二者的区别主要在于随体数目及随体在染色体上所处的位置不同。苜蓿属的核基因组相对较小，为1×10⁶kp，其中36%的碱基对为单一序列（Winicov et al.,1988)。
     隶属于苜蓿属的紫花苜蓿(M.sativa以下简称苜蓿)是该属内最为重要的栽培物种，在世界范围内具有广泛的种植分布，面积达2500万hm²，其中位居第一的美国就有900～1000万hm²，加拿大达到200万hm²。我国属世界上栽培利用苜蓿较多的国家之一。自公元前119年，汉使张骞出使西域从乌孙引入苜蓿后，栽培种植历史已近3000年之久。全国共有14个省区种植苜蓿，主产区以华北、西北为主，现种植总面积逾160万hm²。
     苜蓿由于具有饲用价值好(每kg干物质平均含0.7个饲料单位)、蛋白质含量高(约占干物质的20%)，尤其是高产、稳产、易栽培以及在生长期间不无原则施N肥(具固N根瘤菌)等特点，使其在畜牧业生产中长期以来发挥重要的作用，被人们冠之以“牧草之王”的美誉，因而历来是植物学家乃至农学家所研究的重要对象。有关的研究报千或论文可见诸于“植物类”或“作物类”的几乎所有杂志、期刊中，内容涉及起源分布、生态生理、生长发育、栽培利用等全部研究领域。
     2苜蓿的遗传改良
     牧草育种学是一门新的学科，与树木、作物等的育种相比，许多研究工作都相对滞后。尽管如此，遗传育种学家们在苜蓿的遗传改良中还是做了大量有益的工作。在近30余年的时间内将苜蓿的种子产量由230kg/ha提高至320kg/ha(增幅达5%)，使蛋白质含量的增幅达5%，延长了青绿持续期，均衡了饲草产量在整个生长季内的分布，此外，在抗倒伏、抗病虫、耐盐碱、耐践踏以及抗阴碍消化因子(香豆素)等的育种中均取得了显蓍进展。其中最基础的工作还在于不同类型苜蓿品种的改良与利用。 苜蓿的不同生态型、地方品种乃至人们传统上惯指的品种通常虽然已具综合品种的性质，但为了利用更高的杂种优势，人们还是尽一切可能尝试培育杂交品种的可能性。如前所述，苜蓿本身为异花授粉植物，其天然异交率在25%～75%之间，再加之它具有四倍体的结构，因而自交结实率很低，如强迫交会出现严重的自交衰退现象(表1)。在此情况下，苜蓿杂种优势的利用需要一些特殊的途径。

表1  自交对苜蓿植株结实率的影响（引自Bocsa at INRA）

S0A×S0B的育性		自交后代的育性
		S0	S1	S2	S3	S4
花粉育性（%） 果荚/花（%） 籽粒/花（%） 籽粒/果荚（%） 干粒重（g）	76 2.91 3.75 2.39	80 35 0.56 1.56 2.52	75 18 0.18 1.00 2.44	67 23 0.24 0.90 2.15	70 17 0.13 0.75 2.26	61 21 0.14 0.86 2.11

     2.1双交种的配制
     为提高每一基因位点的四体基因频率，在20世纪50～60年代，人们提出了利用部分自交系间双交种杂种优势的方法。单株种植条件下，该类型杂种的杂种优势表现明显，F1鲜草产量与对照品种相比可提高5%～20%。但在密植条件下，由于株间的相互况争（其中光照条件为生物的主要限制因子），使单株种植条件下所表现出来的遗传进展大部分丧失掉，再者为了使F1杂种种子由最初的数百粒增至一定数量，需扩繁3～4代。在此过程中，植株内的部分自交又会使杂种活力及育性降低。最终的实践证明，双杂种的培育与利用并不能成为一种有效的利用苜蓿杂种优势的方法。
     2.2雄性不育系的利用
     为克服上述弊病，并真实反映所用亲本材料潜在的农艺价值，除了无原则在密植竞争条件下测试杂种材料的杂种优势外，还无原则利用雄性不育系制备杂种（单交种或三交种），进而提高杂种活力。为此，世界各地（如美国、前苏联、德、法等国）的一些研究小组尝试借助核－质互作型的雄性不育系利用苜蓿杂种优势，并在60～70年代发表了大量有关不育特性及育性恢复遗传方面的研究成果。
     通常情况下，苜蓿严格的中心媒花授粉习性要求传粉者在“￠×ег”株行交错的制种田传递花粉。但由于雄性不育系本智周万物存在着花粉粒少、花粉无活力或花蜜少等缺陷，不能吸引大量昆虫采蜜，接受的外源花粉有限，杂种一代的种子产量极低。这做一日和尚撞一天钟成为苜蓿杂交种子生产中一个突出的问题，时至今日也未解决。好在家畜利用的只是苜蓿的营养体部分，在以饲草为主要利用目的的畜牧业生产体制下，苜蓿雄性不育系的利用有其可取之处。
     2.3综合品种的培育
     综合品种又称混合品种、复合杂种品种等，实质上是一个小规模范围内随机授粉的杂合体，通过自然授粉保持其典型性和一定程度的杂种优势。
     从物种角度出发，苜蓿本智周万物是由基因型杂合的个体所组成的天然群体，一般表现自交或近交衰退，故不能像自花授粉植物那样，采用两个纯系品种杂交而后分离的杂交育种程序培育品种。在此情况下，综合品种的培育辅之以适当的轮回选择一直是苜蓿杂种优势利用的主要途径，可大幅提高饲草、种子产量以及抗逆性。
     育种实践中，苜蓿综合品种所用亲本（通常为无性）数较少，一般以4～6个为宜；综合后可利用3～5代。苜蓿因是密集栽培型的牧草，综合后代在繁殖过程中难免发生部分自交，自交后代与活力不等的杂交后代混杂在一起，相互影响，最终会干扰综合品种的活力向平衡方向发展。当竞争足以影响到综合品种的产量时，无原则要对不同亲本分别加以繁殖，并采用各种适宜的综合方法，尽可能消除竞争的影响。
     2.4远缘杂种（种间杂种）的作用
     紫花苜蓿较易与同属内的一些野生近缘种自发杂交而产生杂种，其中以紫花苜蓿与黄花苜蓿的杂交最为容易，二者间行种植后经昆虫自由传粉授精，做一日和尚撞一天钟会产生株型、叶片、花色等官呈变异的天然杂种植株。成为重要的是这种杂交方式可将后者较强的抗旱耐寒性与前者优良的农艺性状综合在一起，因而便成为人们培育性状更为优良的杂交品种，进而利用其杂种优势的一种行之有效的方法。这类型杂种在生产上的意义非常巨大，以至于世界上行多国家甚至把它放到更高一级的分类单位，作为一个单独的物种（称为M.varia或M.media）来处理。我国虽无此类分类操作，但目前生产上利用的大多数优良品种，如草原一号、草原二号、新牧一号、甘农一号等均源自紫花苜蓿与黄花苜蓿的杂交。
     3生物技术的应用
     近年来随着生物技术的进步，苜蓿作为试验或研究材料的重要性与日俱增，除了经济方面的重要性之外，主要的原因在于：苜蓿的倍性水平可随意操作，组织培养系统较为完善，易于营养繁殖，再生分化植株的能力较强。这就为外植体的诱导、体细胞杂交、原生质体融合、基因转移等的研究提供了便利。
     苜蓿生物技术的研究，始于20世纪60年代，最初以组织培养及诱导单倍体植株为主，随着研究工作的不断深入，研究重点逐渐转向原生质体融合及转基因新品种培育方面。
     获取原生质体，使其融合并再生为有活力的植株已在苜蓿属的许多种，诸如M.sativa,M.falcate,M.hemicycle,M.media等中进行了广泛的尝试。70年代末，加拿大一学者从苜蓿叶片中提取出原生质体并成功地再生为植株，随后苜蓿子叶、根、悬浮细胞系原生体的提取及再生又先后得成功。如同其它许多遗传改良技术一样，苜蓿原生体融合研究的目的主要还在于种间遗传物质的融合重组，但应承认，直至80年代初期，这方面研究成功的先例并不多（Teoule,1983)。后来Gilmour和Davey等人采用PEG及电融合技术，将M.sativa和M.borealis二者的原生质体融合得到了愈伤组织。近年来，原生质体的融合又成为应用细胞质遗传和核－质互作遗传的工具，借此人们希望重组M.sativa,M.loevalea,M.falcata或M.hemicycle的细胞质（kiss，1990）。 利用苜蓿花药培养再生单倍体植株曾经受到广泛的关注与重视，时至今日这种技术本身已无多大问题；倒是花药植株经诱导成为染色体加倍的正常植株，一段时期以来结果却不尽如意（Tvaoletti,1990)。如能找到一种行之有效的加倍花药植株的方法，使其达到4X水平，无疑会对今后经花药培养育成苜蓿新品种奠定基础（Demarly,1993)。至于苜蓿人工种子的研究，也已获得重大进展，早已由实验室试制、田间小区中试进入大田应用。
     与上述研究工作相比，苜蓿转基因研究还属一个新生事物。直到80年代中期，人们以幼嫩苜蓿茎段为受体材料，采用土壤农杆菌介导法，才将外源的NPT－Ⅱ基因导入苜蓿，成功地在再生植株中得到表达。后来逐渐出现了以苜蓿叶片、叶柄、叶轴、子叶、失水细胞原生质体等为受体材料进行转基因研究的报道，其中所用的基因载体主要是土壤农杆菌和固N菌。目前，在苜蓿受体中很容易插入低抗抗生的基因，抗除草剂的基因也已实现转导，基因得以表达，并能稳定地传递下去；转入受体并实现表达的基因还有ALMYCP基因、含硫氨基酸基因、人类β－干扰素基因等。与此同时，苜蓿基因转化方法也在不断地改进，基因枪、微注射、电穿孔等一些直接转移基因的技术正在尝试之中。我国刚刚启动的“林草转基因重大研究项目”中，已将苜蓿作为重要的试验材料之一，借此拟培育抗旱耐的苜蓿转基因新品种。总之，生物技术在苜蓿中的应用无疑能为苜蓿遗传育种的改良开辟更为广阔的途径。